迈尔斯·莫拉莱斯
沙梅克·摩尔饰
终极宇宙里的蜘蛛侠，被一只放射性蜘蛛咬伤，并因此获得了超能力。偶然和其他宇宙的蜘蛛侠相遇，将和他们共同对抗最强反派。
彼得·帕克
杰克·M·约翰森饰
616宇宙的蜘蛛侠，他帮助训练迈尔斯·莫拉莱斯正视自己，勇于承担肩上的责任，在这期间也慢慢的找回自我。
格温·史黛西
海莉·斯坦菲尔德饰
她是一个非常聪明、反应极快的女孩儿，能够以宛如舞者般优雅的身姿穿梭往来，是65号宇宙的蜘蛛侠。
潘妮·帕克
贵美子·格伦饰
14512宇宙的蜘蛛侠，一个来自未来的蜘蛛女孩，还拥有一个机器人助手。
金并
列维·施瑞博尔饰
超级反派，他建立起一台高度隐秘的超级对撞机，这台对撞机开启了通往其他宇宙的时空通道，导致来自其他宇宙、不同版本的蜘蛛侠也来到了迈尔斯所在的世界。
绿魔
乔玛·塔科内饰
绿魔本名诺曼·奥斯本，是奥氏集团的董事长，在注射了自己公司研发的“人体强化药剂”之后，获得了远超常人的各项体能。是蜘蛛侠的头号宿敌。
蝎子（蝎王）
华金·科西奥饰
本名麦克唐纳·加根，原本是一名私家侦探，他的下半身和左手臂都是蝎型装甲，蝎尾还装上了震荡弹、催泪弹甚至酸等各种攻击技能。
